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HTRF AMPK P-T172 KIT - 50K PTS

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概述

5' 腺苷一磷酸激活蛋白激酶（AMPK）被视为代谢的主开关。AMPK 可通过 CaMKK2 和 LKB1 等在苏氨酸 172（Thr172）位点发生磷酸化而被激活。激活后，它会抑制脂肪酸、胆固醇和甘油三酯的合成，激活脂肪酸摄取和 β- 氧化，还能刺激葡萄糖摄取。AMPK 还通过直接磷酸化 ULK1 参与自噬激活。Revvity 的基于细胞的均相 HTRF 磷酸化 AMPK（Thr172）试剂盒能够定量检测在苏氨酸 172 位点磷酸化的 AMP 激活蛋白激酶的调节情况。

工作原理

磷酸化 AMPK（Thr172）检测原理

磷酸化 AMPK（Thr172）检测用于测量在 Thr172 位点发生磷酸化的 AMPK。与蛋白质印迹法不同，该检测完全基于微孔板进行，无需凝胶、电泳或转膜步骤。磷酸化 AMPK（Thr172）检测使用两种标记抗体：一种标记有供体荧光团，另一种标记有受体荧光团。第一种抗体经筛选可特异性结合蛋白质上的磷酸化基序，第二种抗体则能不依赖于蛋白质的磷酸化状态识别该蛋白质。蛋白质磷酸化会促使形成包含两种标记抗体的免疫复合物，使供体荧光团与受体荧光团靠近，从而产生荧光共振能量转移（FRET）信号。信号强度与样品中磷酸化蛋白质的浓度直接成正比，且该检测采用无需洗涤的形式，为评估蛋白质的磷酸化状态提供了途径。

phospho-how-it-works-phospho-ampk-thr172-assay-principle（磷酸化 AMPK（Thr172）检测原理示意图）

磷酸化 AMPK（Thr172）双板检测方案

双板方案包括：先在 96 孔板中培养细胞，然后进行裂解，再将裂解物转移至 384 孔小体积检测板中，之后加入磷酸化 AMPK（Thr172）HTRF 检测试剂。该方案能够监测细胞活力和汇合度。

磷酸化 AMPK（Thr172）单板检测方案

使用 HTRF 试剂检测磷酸化 AMPK（Thr172）可在单个用于培养、刺激和裂解的板中进行，无需洗涤步骤。这种为高通量筛选（HTS）设计的方案可实现微型化，同时保持稳定的 HTRF 质量。

检测验证

多索吗啡对 HepG2 肝细胞中磷酸化 AMPK 的抑制作用

将 50,000 个人 HepG2 细胞接种到 96 孔板中，在 37°C、5% CO₂条件下孵育 24 小时。用不同浓度的多索吗啡孵育 4 小时后，移除培养基，用 50µL 裂解缓冲液在室温下轻轻振荡 30 分钟裂解细胞。取 16µL 裂解物转移到 384 孔小体积白色微孔板中，加入 4µL HTRF 磷酸化 AMPK（Thr172）检测试剂。孵育过夜后记录 HTRF 信号。

细胞应激对小鼠 C2C12 细胞中 AMPK 磷酸化的影响

将 50,000 或 100,000 个细胞接种到 96 孔板中，在 37°C、5% CO₂条件下孵育 24 小时。用不同浓度的 H₂O₂孵育 10 分钟（从而诱导细胞应激）后，移除培养基，用 50µL 裂解缓冲液在室温下轻轻振荡 30 分钟裂解细胞。取 16µL 裂解物转移到 384 孔小体积白色微孔板中，加入 4µL HTRF 磷酸化 AMPK（Thr172）检测试剂。孵育过夜后记录 HTRF 信号，结果清晰显示 AMPK 在 Thr172 位点的磷酸化水平增加。

简化通路

AMPK 简化通路

腺苷一磷酸激活蛋白激酶（AMPK）在调节细胞代谢和代谢激素方面发挥着重要作用。它在 Thr172 位点发生磷酸化时被激活。AMPK 最初被定义为关键代谢酶乙酰辅酶 A 羧化酶（ACC1 和 ACC2）以及 HMG 辅酶 A 还原酶的上游激酶。AMPK 刺激分解代谢，同时抑制合成代谢通路，并直接作用于下丘脑以调节食欲。AMPK 对胰岛素合成的调节，尤其是其在葡萄糖转运中的作用，使其成为代谢疾病研究的热门靶点。

规格

其他规格

应用：细胞信号传导
品牌：HTRF
检测方式：HTRF
分子修饰：磷酸化
产品类别：试剂盒
样品体积：16µL
运输条件：干冰运输
靶标类别：磷酸化蛋白
靶标物种：人、小鼠
技术：时间分辨荧光共振能量转移（TR-FRET）
治疗领域：代谢 / 糖尿病、非酒精性脂肪性肝炎 / 肝纤维化
单位规格：50,000 个检测点

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货号：64MPKPEY

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