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HTRF SHP2 TOTAL KIT - 10K PTS

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概述

总 SHP2 细胞检测可监测 SHP2（含 Src 同源 2 结构域蛋白酪氨酸磷酸酶 2）的表达水平，并可作为我们磷酸化 SHP2 Y542（酪氨酸 542 位点磷酸化）检测试剂盒的归一化检测工具。由于磷酸化 SHP2 检测与总 SHP2 检测具有兼容性，这两种试剂盒可在同一份裂解物样本上并行使用。

许多癌细胞会过度表达 PD-L1（程序性死亡配体 1）等检查点抑制剂配体。PD-L1 可与其对应的检查点抑制剂受体 PD1（程序性死亡受体 1，存在于 T 淋巴细胞表面）结合。随后，PD1-PDL1 复合物会招募并激活 SHP1（含 Src 同源 2 结构域蛋白酪氨酸磷酸酶 1）或 SHP2 等抑制性效应因子。这两种磷酸酶分别在 Lck 激酶的作用下发生 Tyr564（酪氨酸 564 位点）和 Tyr542（酪氨酸 542 位点）磷酸化，进而触发 T 细胞活化通路中 ZAP-70（ζ 链相关蛋白激酶 70）或 SLP-76（SH2 结构域淋巴细胞蛋白 76）等信号蛋白的去磷酸化。最终，活化的 SHP1 和 SHP2 会参与 T 细胞的失活过程。

研究认为，通过小分子抑制剂阻止 SHP1 和 / 或 SHP2 的活化，有助于恢复机体对肿瘤的免疫应答。

工作原理

总 SHP2 检测原理

总 SHP2 检测可测量 SHP2 的表达水平，且不受其磷酸化状态的影响。与蛋白质印迹法（Western Blot，WB）不同，该检测为全板基检测，无需凝胶、电泳或转膜步骤。总 SHP2 检测使用两种标记抗体：一种偶联供体荧光团，另一种偶联受体荧光团。两种抗体均对 SHP2 蛋白上的特定表位具有高度特异性。当细胞提取物中存在 SHP2 时，加入这些抗体偶联物后，供体荧光团与受体荧光团会近距离接触，进而产生 FRET（荧光共振能量转移）信号。该信号强度与样本中 SHP2 蛋白的浓度直接成正比，且该检测采用 “无需洗涤” 的检测格式，为评估 SHP2 蛋白表达提供了便捷手段。

（标注：phospho-how-it-works-total-shp2-assay-principle）

总 SHP2 双板检测方案

双板检测方案的流程为：先在 96 孔板中培养细胞，裂解后将裂解物转移至 384 孔低体积检测板，再加入总 SHP2 HTRF（均相时间分辨荧光）检测试剂。该方案可对细胞活力和汇合度进行监测。

（标注：phospho-how-it-works-total-shp2-2-plate-assay-protocol）

总 SHP2 单板检测方案

使用 HTRF 试剂检测总 SHP2 可在单个培养板中完成，该培养板同时用于细胞培养、刺激和裂解，无需洗涤步骤。此为高通量筛选（HTS）设计的方案，可实现实验微型化，同时保持稳定的 HTRF 检测质量。

（标注：phospho-how-it-works-total-shp2-1-plate-assay-protocol）

检测验证

在 Jurkat T 细胞中使用 Lck 抑制剂萨拉卡替尼（Saracatinib）进行药理学验证

将人 Jurkat 悬浮细胞以每孔 100,000 个细胞的密度接种到 96 孔半区板中，在 37°C、5% 二氧化碳（CO₂）条件下，与浓度递增的萨拉卡替尼共同孵育 24 小时。裂解前，Jurkat 细胞与 30μM 过钒酸盐（Pervanadate）孵育 30 分钟，随后加入 10μL 4 倍浓度（4X）的补充裂解缓冲液。在室温（RT）下轻轻振荡裂解 30 分钟后，取 16μL 裂解物转移至 384 孔低体积白色微孔板中，并加入 4μL HTRF 磷酸化 SHP2（Tyr542）或总 SHP2 检测试剂。孵育过夜后记录 HTRF 信号。

如其他研究所述，经萨拉卡替尼处理后，可观察到 SHP2 Tyr542 磷酸化的剂量依赖性抑制。

（标注：assay-validation-shp2-total-1）

对经 PDGF（血小板衍生生长因子）刺激的 NIH-3T3 小鼠细胞进行药理学验证

将小鼠 NIH-3T3 贴壁细胞以每孔 100,000 个细胞的密度接种到 96 孔板中，在 37°C、5% CO₂条件下孵育。无血清培养过夜后，用浓度递增的 PDGF 刺激细胞 20 分钟。收集细胞培养基，加入 50μL 补充裂解缓冲液裂解细胞。在室温下轻轻振荡裂解 30 分钟后，取 16μL 裂解物转移至 384 孔低体积白色微孔板中，并加入 4μL HTRF 磷酸化 SHP2（Tyr542）或总 SHP2 检测试剂。孵育 4 小时后记录 HTRF 信号。

结果显示，PDGF 刺激可诱导 NIH-3T3 细胞中 SHP2 Tyr542 发生显著磷酸化，而在相同实验条件下，SHP2 的表达水平保持稳定。

（标注：assay-validation-shp2-total-2）

HTRF 检测与蛋白质印迹法（Western Blot）的比较

将人 Jurkat 细胞系接种到 T175 培养瓶中，在 37°C、5% CO₂条件下孵育。用 30μM 过钒酸盐处理细胞 30 分钟后进行裂解。用补充裂解缓冲液对细胞裂解物进行系列稀释，取 16μL 各稀释液转移至低体积白色微孔板中，随后加入 4μL HTRF 磷酸化 SHP2 检测试剂。取等量裂解物，通过 HTRF 检测与蛋白质印迹法进行平行对比。结果显示，使用 HTRF 总 SHP2 检测时，每孔仅需 1,250 个细胞即可检测到信号；而使用基于 ECL（化学发光）检测的蛋白质印迹法时，需 20,000 个细胞才能检测到信号。这些结果表明，HTRF 总 SHP2 检测的灵敏度是蛋白质印迹法的 16 倍。

（标注：assay-validation-shp2-total-3）

简化通路

SHP2 的功能与调控

SHP1（又称非受体型酪氨酸蛋白磷酸酶 6，PTPN6）是一种主要在造血细胞中表达的酪氨酸磷酸酶，可被 Lck 激酶激活，并通过细胞表面受体招募。SHP2（又称非受体型酪氨酸蛋白磷酸酶 11）在造血细胞和非造血细胞中均广泛表达。尽管 SHP2 对 T 细胞活化起负调控作用，但在响应 PDGF 或 FGF（成纤维细胞生长因子）等生长因子时，它对 ERK（细胞外信号调节激酶）的活化起正调控作用。

在 T 淋巴细胞中，SHP1 和 SHP2 会被免疫检查点抑制剂招募，进而参与 TCR（T 细胞受体）信号通路的抑制。SHP1 和 SHP2 可与 PD1 的 ITIM（免疫受体酪氨酸抑制基序）结构域相互作用，并在 Lck 激酶的作用下发生磷酸化而激活。活化的 SHP1 和 SHP2 磷酸酶会导致 TCR 信号通路中关键效应因子（如 ZAP70 或 SLP76）的去磷酸化，而这些因子是 T 细胞增殖和功能发挥所必需的。

（标注：phospho-pathway-shp2-total-kit-64nh2peg）

规格参数

其他规格

应用领域：细胞信号传导
品牌：HTRF
检测方式：HTRF（均相时间分辨荧光）
兼容裂解缓冲液：
- 2 号裂解缓冲液
- 3 号裂解缓冲液
分子修饰类型：总蛋白（非磷酸化特异性）
产品类别：试剂盒（Kit）
样本体积：16μL
运输条件：干冰运输
靶标类别：磷酸化蛋白（Phosphoproteins）
靶标物种：
- 人（Human）
- 小鼠（Mouse）
技术原理：TR-FRET（时间分辨荧光共振能量转移）
治疗领域：
- 传染病（Infectious Diseases）
- 肿瘤学与炎症（Oncology & Inflammation）
单位规格：10,000 个检测点（assay points）

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货号：64NH2PEH

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