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HTRF (H) SMARCA2 TOTAL KIT - 50K PTS

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概述

SMARCA 基因亚组属于 SWI/SNF 家族，参与染色质重塑和 DNA 损伤修复。SWI/SNF 复合体调控涉及 DNA 复制、损伤修复和细胞增殖等基本过程的基因。

SMARCA4/BRG1 和 SMARCA2/BRM 是 SWI/SNF 复合体中两个互斥的催化性 ATP 酶亚基。

SMARCA4 功能缺失常与癌症相关，且在 SMARCA4 缺陷型癌症中，SMARCA4 和 SMARCA2 之间的合成致死关系已得到充分证实 —— 在这种情况下，SMARCA2 的失活会导致肿瘤细胞死亡。

在正在研究的抗癌治疗策略中，靶向蛋白降解有望克服传统小分子药物的一些局限性。迄今为止，已开发出 PROTAC 分子来诱导 SMARCA 蛋白的选择性降解。然而，SMARCA2 和 SMARCA4 在蛋白质水平上有约 75% 的同源性，因此化合物可能会同时靶向这两种蛋白质。因此，必须仔细研究靶向 SMARCA2 或 SMARCA4 的化合物的选择性。在这类研究中，HTRF 总 SMARCA4 检测试剂盒是 HTRF 总 SMARCA2 检测试剂盒的重要配套检测工具，可实现可靠的化合物分析。

工作原理

总 SMARCA2 检测原理

HTRF 总 SMARCA2 检测可定量细胞裂解物中 SMARCA2 的表达水平。与蛋白质印迹法（Western Blot）不同，该检测完全基于微孔板，无需凝胶、电泳或转膜步骤。总 SMARCA2 检测使用两种标记抗体：一种与供体荧光团偶联，另一种与受体荧光团偶联。两种抗体都对该蛋白质上的特定表位具有高度特异性。当细胞提取物中存在 SMARCA2 时，添加这些偶联物会使供体荧光团与受体荧光团接近，从而产生 FRET 信号。其强度与样品中蛋白质的浓度直接成正比，并提供了一种在无需洗涤的检测格式中评估蛋白质表达的方法。

总 SMARCA2 双板检测方案

双板方案包括在 96 孔板中培养细胞，裂解后将裂解物转移到 384 孔小体积检测板中，然后添加总 SMARCA2 HTRF 检测试剂。该方案能够监测细胞活力和汇合度。

总 SMARCA2 单板检测方案

使用 HTRF 试剂检测总 SMARCA2 可在单个用于培养、刺激和裂解的板中进行，无需洗涤步骤。这种为高通量筛选（HTS）设计的方案能够实现微型化，同时保持稳定的 HTRF 质量。

检测验证

使用相关细胞系验证 HTRF 总 SMARCA2 检测的特异性

使用 HTRF 总 SMARCA2 试剂盒评估 A549（肺癌）和 HAP1 细胞（野生型，WT）中 SMARCA2 的表达水平。同时，使用 HTRF 总 SMARCA4 试剂盒评估 SMARCA4 的表达水平。事先对细胞密度进行了优化，以确保 HTRF 检测在试剂盒的动态范围内（数据未显示）。

将不同的细胞系接种在 96 孔培养板中，密度为 200,000 个细胞 / 孔，并在 37°C、5% CO₂条件下孵育 24 小时。去除培养基后，用 50 µL 补充的 1X 裂解缓冲液 #1 在室温下轻轻振荡裂解细胞 30 分钟。然后将 16 µL 细胞裂解物转移到小体积白色微孔板中，随后加入 4 µL 预混合的检测试剂。在室温下孵育过夜后记录 HTRF 信号。

在 A549 细胞中检测到 SMARCA2 的低表达，而 SMARCA4 的表达与非特异性信号（虚线）相当，这表明 SMARCA4 缺乏表达，正如文献（Hoffman, G. R. 等人，《美国国家科学院院刊》，2014 年）所描述的那样。

此外，HAP1 细胞中 SMARCA2 的表达水平与非特异性信号（虚线）相当，表明 SMARCA2 缺乏表达，而正如预期的那样，在 HAP1 细胞中可很好地检测到 SMARCA4 的水平。

这些结果证明，尽管 SMARCA2 和 SMARCA4 这两种蛋白质具有超过 70% 的序列同源性，但 HTRF SMARCA2 试剂盒对 SMARCA4 具有特异性。

细胞系参考目录（Horizon Discovery）：HAP1 野生型 #C631。

在多种人类细胞系上的验证

将贴壁人类细胞系 HeLa（宫颈）、HEK293（肾脏）和 A549（肺癌）接种在 96 孔培养板中，密度为 200,000 个细胞 / 孔，并在 37°C、5% CO₂条件下孵育 24 小时。去除培养基后，用 50 µL 补充的 1X 裂解缓冲液 #1 在室温下轻轻振荡裂解细胞 30 分钟。

将悬浮人类细胞系 HEL92.1.7（红白血病）和 MOLT-4（T 淋巴母细胞白血病）以 30 µL 的体积接种到 96 孔板中，密度为 200,000 个细胞 / 孔，在 37°C、5% CO₂条件下孵育 1 小时，然后用 10 µL 补充的 4X 裂解缓冲液 #1 在室温下轻轻振荡裂解 30 分钟。

使用 HTRF 总 SMARCA2 试剂盒评估 SMARCA2 的表达水平。简要步骤为：将 16 µL 细胞裂解物转移到小体积白色微孔板中，然后加入 4 µL 预混合的 HTRF 检测试剂。在室温下孵育过夜后记录 HTRF 信号。虚线对应非特异性 HTRF 信号。请注意，事先对细胞密度进行了优化，以确保 HTRF 检测在试剂盒的动态范围内（数据未显示）。

HTRF 总 SMARCA2 检测能有效检测各种表达不同水平该蛋白质的细胞模型中的内源性 SMARCA2。

PROTAC® 诱导的 SMARCA2 降解

将 HEL92.1.7 细胞接种在 96 孔板中（100,000 个细胞 / 30µL 孔），并用不同浓度的 PROTAC® 化合物 ACBI1 和 AU-15330 处理，同时使用 PROTAC ARV-471（PROTAC® 雌激素受体）作为阴性无关对照。孵育过夜后，用 10 µL 补充的 4X 裂解缓冲液 #1 在室温下轻轻振荡裂解细胞 30 分钟。细胞裂解后，将 16 µL 裂解物转移到 384 孔小体积白色微孔板中，并加入 4 µL HTRF 总 SMARCA2 检测抗体。孵育过夜后记录 HTRF 信号。

用两种 SMARCA2 PROTAC® 降解剂处理细胞后，SMARCA2 蛋白呈剂量依赖性减少，而在 ARV-471 对照条件下，SMARCA2 的表达水平以及 ATP 水平保持稳定。这些结果表明 PROTAC® 诱导了特异性的 SMARCA2 降解，其 DC50 * 在纳摩尔范围内，与预期一致（Farnabay, W. 等人，《自然化学生物学》，2019 年；Xiao, L. 等人，《自然》，2022 年）。

*DC50 指降解剂使 50% 的靶蛋白降解时的浓度。

PROTAC® 对 SMARCA2 与 SMARCA4 的分析对比

将 HEL92.1.7 细胞接种在 96 孔板中（100,000 个细胞 / 30µL 孔），并用不同浓度的 PROTAC® 化合物 ACBI1 和 AU-15330 处理。孵育过夜后，用 10 µL 补充的 4X 裂解缓冲液 #1 在室温下轻轻振荡裂解细胞 30 分钟。细胞裂解后，将 16 µL 裂解物转移到 384 孔小体积白色微孔板中，并加入 4 µL HTRF 检测抗体，使用总 SMARCA2 或总 SMARCA4 检测试剂。孵育过夜后记录 HTRF 信号。

结果表明，ACBI1 和 AU-15330 诱导 SMARCA2 和 SMARCA4 呈剂量依赖性减少。在相同条件下，ATP 水平保持稳定（数据未显示）。这些结果与 Farnabay, W. 等人（《自然化学生物学》，2019 年）和 Xiao, L. 等人（《自然》，2022 年）的研究一致。

PROTAC®	所述蛋白质靶点	E3 连接酶配体	DC50（纳摩尔）
			总 SMARCA2	总 SMARCA4
ACBI1	SMARCA2、SMARCA4、PBRM1	VHL 配体	224	231
AU-15330	SMARCA2、SMARCA4、PBRM1	VHL 配体	242	620

HTRF 总 SMARCA2 检测与蛋白质印迹法（Western Blot）的比较

在含完全培养基的 T175 培养瓶中培养 HEL92.1.7 细胞，置于 37°C、5% CO₂条件下。孵育 24 小时后去除细胞培养基，用 3 mL 补充的 1X 裂解缓冲液 #1 在室温下轻轻振荡裂解细胞 30 分钟。

使用补充的裂解缓冲液 #1 对细胞裂解物进行系列稀释，将 16 µL 每种稀释液转移到小体积白色微孔板中，然后加入 4 µL HTRF 总 SMARCA2 检测试剂。

使用等量的裂解物进行 HTRF 和蛋白质印迹法的平行比较。

在这些条件下，HTRF 总 SMARCA2 检测与蛋白质印迹法具有同等的灵敏度。

简化通路

SMARCA2 信号通路

SMARCA2 和 SMARCA4 是 SWI/SNF 复合体中的催化亚基，参与 DNA 转录和修复。SMARCA2 和 SMARCA4 包含 6 个不同的结构域，包括 DNA 依赖性 ATP 酶结构域和溴结构域（Bromo domain）。溴结构域和 H3K27 乙酰化水平调控 DNA 与 SWI/SNF 复合体之间的结合，而 ATP 酶结构域催化两条 DNA 链的分离。这些功能被 PRC2 复合体的 EZH2 催化亚基所拮抗，EZH2 会抑制基因转录。SMARCA2 或 SMARCA4 的功能缺失会导致 DNA 损伤增加，因为 PRC2 会继续与核小体结合并抑制 DNA 修复。

规格参数

其他规格

应用领域：细胞信号传导
品牌：HTRF
检测方式：HTRF
兼容的裂解缓冲液：裂解缓冲液 1、裂解缓冲液 2、裂解缓冲液 4
分子修饰：总（蛋白）
产品类别：试剂盒
样品体积：16 µL
运输条件：干冰运输
靶标类别：磷酸化蛋白
靶标物种：人类
技术：时间分辨荧光共振能量转移（TR-FRET）
单位规格：500 个检测点

没有数据

货号：64SMARC2TPEY

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