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HTRF C-SRC P-Y419 KIT - 10K PTS

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概述

磷酸化 c-Src（Tyr419）检测（Phospho-c-Src (Tyr419) Assay）旨在监测 c-Src 蛋白的表达水平及其在 Tyr419 位点的自磷酸化水平 —— 该位点的自磷酸化是 c-Src 激活的关键标志之一，广泛应用于癌症研究领域。

c-Src 属于 Src 激酶家族，与该家族其他 10 个成员具有高度的序列同源性。作为一种膜相关非受体酪氨酸激酶，其 Tyr419 位点发生自磷酸化时，意味着蛋白达到完全激活状态。在多种人类癌症中，c-Src 激酶常出现过表达且活性显著升高的现象，成为癌症研究中的重要靶点。

工作原理

磷酸化 c-Src Tyr (419) 检测原理

磷酸化 c-Src Tyr (419) 检测可定量分析 c-Src 蛋白在 419 位酪氨酸（Tyr419）的磷酸化水平。与蛋白质印迹法（Western Blot）不同，该检测为全板基操作，无需使用凝胶、进行电泳或转膜步骤，大幅简化实验流程。

检测过程中采用两种标记抗体：一种偶联供体荧光团，另一种偶联受体荧光团。其中，第一种抗体具备特异性结合蛋白磷酸化基序的能力，仅识别 Tyr419 磷酸化后的 c-Src；第二种抗体则不依赖蛋白磷酸化状态，可普遍识别 c-Src 蛋白本身。当 c-Src 发生磷酸化时，两种抗体可共同结合于目标蛋白，形成免疫复合物，使供体荧光团与受体荧光团近距离接触，进而产生荧光共振能量转移（FRET）信号。该信号的强度与样本中磷酸化 c-Src 的浓度直接成正比，且可在免洗涤的检测模式下，快速评估蛋白的磷酸化状态。

（图示标注：phospho-how-it-works-phospho-c-src-tyr149-assay-principle.svg，即 “磷酸化 c-Src Tyr (419) 检测原理示意图”）

磷酸化 c-Src Tyr (419) 双板检测方案

双板检测方案的操作流程为：先在 96 孔板中完成细胞培养，待细胞培养至目标状态后进行裂解；随后将裂解液转移至 384 孔小体积检测板中，最后加入磷酸化 c-Src Tyr (419) HTRF 检测试剂进行信号检测。该方案的优势在于可同步监测细胞的活力与汇合度，为实验结果的可靠性提供额外参考。

（图示标注：phospho-how-it-works-phospho-c-src-tyr149-2-plate-assay-protocol.svg，即 “磷酸化 c-Src Tyr (419) 双板检测方案流程示意图”）

磷酸化 c-Src Tyr (419) 单板检测方案

使用 HTRF 试剂检测磷酸化 c-Src Tyr (419) 时，可在同一培养板中完成细胞培养、刺激处理与裂解操作，无需洗涤步骤。该方案专为高通量筛选（HTS）设计，既能实现实验微型化以节省样本与试剂用量，又能保持 HTRF 检测技术特有的稳定可靠性，适用于大规模药物筛选或批量样本分析。

（图示标注：phospho-how-it-works-phospho-c-src-tyr149-2-plate-assay-protocol.svg，即 “磷酸化 c-Src Tyr (419) 单板检测方案流程示意图”）

检测验证

利用 siRNA 在 HEK293 细胞中验证 c-Src 相关 HTRF 检测的特异性

将人 HEK293 胚胎肾细胞接种至培养板后培养 24 小时，随后分为两组：一组用 c-Src siRNA（小干扰 RNA）转染以沉默 c-Src 基因，另一组用阴性对照 siRNA 转染；之后用浓度递增的过氧化氢（H₂O₂）处理细胞，诱导 c-Src 激活，再移除培养基并裂解细胞。将裂解液转移至 384 孔小体积白色微孔板中，加入试剂盒检测试剂并记录信号。

结果显示：与转染阴性对照 siRNA 的细胞相比，转染 c-Src siRNA 的细胞其 HTRF 信号显著下降约 75%。这一结果表明，该检测试剂盒对 c-Src 具有高度特异性，不会与 Src 家族的其他成员发生交叉反应，确保检测结果的准确性。

（图示标注：assay-validation-c-src-phospho-y419-1.svg，即 “利用 siRNA 在 HEK293 细胞中验证 c-Src HTRF 检测特异性的结果图”）

在 A431 癌细胞中对比磷酸化 c-Src 的 HTRF 检测与 Western Blot 检测

将人 A431 癌细胞接种到 T175 培养瓶中培养，直至细胞汇合度达到 80%；细胞裂解后，通过离心收集可溶性上清液，用补充型裂解缓冲液进行系列稀释，随后将稀释后的裂解液转移至 384 孔小体积白色微孔板中，分别加入 HTRF 磷酸化 c-Src 检测试剂与总 c-Src 检测试剂。

同时，取等量裂解液进行蛋白质印迹实验（Western Blot），与 HTRF 检测结果进行平行对比。结果显示：磷酸化 c-Src 的 HTRF 检测灵敏度是 Western Blot 的 32 倍，而总 c-Src 的 HTRF 检测灵敏度是 Western Blot 的 8 倍，充分体现 HTRF 检测在灵敏度上的显著优势。

（图示标注：assay-validation-c-src-phospho-y419-2.png，即 “A431 细胞中磷酸化 c-Src HTRF 检测与 Western Blot 检测对比结果图”）

博舒替尼（Bosutinib）对 HEK293 细胞中 c-Src 活性的抑制作用

将 HEK293 细胞以 1×10⁵个细胞 / 孔的密度接种到 96 孔板中，在 37°C、5% 二氧化碳（CO₂）条件下孵育 24 小时；先用浓度递增的博舒替尼（一种 c-Src 激酶抑制剂）处理细胞 30 分钟，再用 20 毫摩尔（mM）的 H₂O₂刺激细胞 10 分钟以诱导 c-Src 激活；之后移除培养基，用 50 微升（µL）3 号补充型裂解缓冲液在室温下轻柔振荡裂解细胞 30 分钟。

取 16 微升裂解液转移至 384 孔小体积白色微孔板中，分别加入 4 微升 HTRF 磷酸化 c-Src 检测试剂与总 c-Src 检测试剂，孵育 4 小时后记录 HTRF 信号，以分析博舒替尼对 c-Src 活性的抑制效果。

（图示标注：assay-validation-c-src-phospho-y419-3.svg，即 “博舒替尼抑制 HEK293 细胞 c-Src 活性的实验结果图”）

利用 H₂O₂激活人 A431 表皮样癌细胞中的 c-Src

将 A431 细胞以 1×10⁵个细胞 / 孔的密度接种到 96 孔板中，在 37°C、5% 二氧化碳条件下孵育 24 小时；用浓度递增的 H₂O₂处理细胞 10 分钟，通过 H₂O₂诱导的氧化应激激活 c-Src；之后移除培养基，用 50 微升 3 号补充型裂解缓冲液在室温下轻柔振荡裂解细胞 30 分钟。

取 16 微升裂解液转移至 384 孔小体积白色微孔板中，分别加入 4 微升 HTRF 磷酸化 c-Src 检测试剂与总 c-Src 检测试剂，孵育 4 小时后记录 HTRF 信号，以观察 H₂O₂浓度对 c-Src 激活水平的影响。

（图示标注：assay-validation-c-src-phospho-y419-4.svg，即 “H₂O₂激活 A431 细胞 c-Src 的实验结果图”）

在其他人类癌细胞系中的验证

在经预处理的 96 孔培养板中，分别接种人 HepG2 肝细胞癌细胞、人 HeLa 宫颈癌细胞和人 MCF-7 乳腺癌细胞；待细胞培养至目标状态后，用 50 微升 3 号补充型裂解缓冲液在室温下轻柔振荡裂解细胞 30 分钟。

取 16 微升裂解液转移至 384 孔小体积白色微孔板中，分别加入 4 微升 HTRF 磷酸化 c-Src 检测试剂与总 c-Src 检测试剂，孵育 4 小时后记录 HTRF 信号。该实验验证了该检测试剂盒在多种人类癌细胞系中的适用性，确保其在不同癌症研究场景下的可靠性。

（图示标注：assay-validation-c-src-phospho-y419-5.svg，即 “多种人类癌细胞系中 c-Src 检测的验证结果图”）

H₂O₂处理的小鼠 NIH/3T3 细胞的细胞密度实验

将小鼠 NIH/3T3 胚胎成纤维细胞以不同密度（模拟不同细胞丰度场景）接种到 96 孔板中，在 37°C、5% 二氧化碳条件下孵育 24 小时；次日，用浓度递增的 H₂O₂处理细胞 10 分钟以激活 c-Src；之后移除培养基，用 50 微升 3 号补充型裂解缓冲液在室温下轻柔振荡裂解细胞 30 分钟。

取 16 微升裂解液转移至 384 孔小体积白色微孔板中，分别加入 4 微升 HTRF 磷酸化 c-Src 检测试剂与总 c-Src 检测试剂，孵育 4 小时后记录 HTRF 信号。该实验用于验证细胞密度对检测结果的影响，确保检测在不同细胞数量条件下的稳定性。

（图示标注：assay-validation-c-src-phospho-y419-6.svg，即 “H₂O₂处理的 NIH/3T3 细胞密度实验结果图”）

博舒替尼处理的 HEK293 细胞中 HTRF 检测与 ELISA 检测的相关性

将 HEK293 细胞接种并培养 24 小时；先用浓度递增的博舒替尼处理细胞，再用 H₂O₂刺激细胞 10 分钟以激活 c-Src；之后移除培养基，分别用 ELISA（酶联免疫吸附试验，传统定量检测方法）试剂盒试剂与 HTRF 试剂盒试剂裂解细胞。

分别检测 HTRF 信号（荧光信号）和 ELISA 比色信号，结果显示：两种方法测得的博舒替尼 IC50（半数抑制浓度，评估抑制剂活性的关键指标）值相近。这一结果表明，HTRF 检测与传统 ELISA 检测具有良好的相关性，可作为可靠的替代检测方法。

（图示标注：assay-validation-c-src-phospho-y419-7.svg，即 “HEK293 细胞中 c-Src HTRF 检测与 ELISA 检测的相关性结果图”）

简化通路：c-Src 信号通路

c-Src 是一种膜相关非受体蛋白酪氨酸激酶，在所有细胞类型中均有广泛表达，其活性受到严格调控：当 c-Src 的 Tyr530 位点发生磷酸化时，激酶处于失活状态；而当 Tyr530 位点去磷酸化后，Tyr419 位点发生自磷酸化，是 c-Src 完全激活的核心标志。

c-Src 的激活主要依赖于受体酪氨酸激酶（RTKs）、整合素（细胞黏附分子）和活性氧（ROS）的调控，作为关键的信号中介分子，它可调控多种下游信号通路，包括 AKT 通路（调控细胞存活）、MAPK 通路（调控细胞增殖与分化）、STAT 通路（调控基因表达）和 NF-κB 通路（调控炎症与免疫反应），进而参与调节细胞增殖、分化、存活、形态形成、黏附和迁移等核心生理过程。因此，精确调控 Src 活性对维持正常细胞生长至关重要。

作为一种原癌基因衍生的基因，c-Src 在多种人类癌症（如乳腺癌、结肠癌、胰腺癌等）中常出现过表达且活性高度激活的情况，使其成为癌症治疗领域极具潜力的靶点，相关检测技术也成为癌症机制研究与药物开发的重要工具。

（图示标注：phospho-pathway-c-src-64srcpeg-64srcpeh-64srcpey.svg，即 “c-Src 信号通路简化示意图”）

规格参数

应用领域：细胞信号传导
品牌：HTRF
检测方式：HTRF（均相时间分辨荧光）
裂解缓冲液兼容性：3 号裂解缓冲液、4 号裂解缓冲液、5 号裂解缓冲液
分子修饰类型：磷酸化（Phosphorylation）
产品类别：试剂盒（Kit）
样本体积：16 微升（µL）
运输条件：干冰运输
靶点类别：磷酸化蛋白
靶点物种：人、小鼠
技术平台：TR-FRET（时间分辨荧光共振能量转移）
治疗领域：肿瘤学与炎症（Oncology & Inflammation）
单位规格：10,000 个检测点

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货号：64SRCPEH

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