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HTRF C-SRC P-Y419 KIT - 50K PTS

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概述

磷酸化 c-Src（Tyr419）检测试剂盒旨在监测 c-Src 在 Tyr419 位点的表达水平和自磷酸化情况，这是其激活的标志之一，常用于癌症研究。c-Src 是 Src 激酶家族的成员，与其他 10 个家族成员具有高度的序列同源性。该蛋白是一种膜相关的非受体酪氨酸激酶，其 Tyr419 残基的自磷酸化标志着其完全激活。在许多人类癌症中，c-Src 激酶存在过表达和高度激活的现象。

工作原理

磷酸化 c-Src Tyr（419）检测原理

磷酸化 c-Src Tyr（419）检测用于测量在 419 位点发生磷酸化的 c-Src。与蛋白质印迹法不同，该检测完全基于微孔板进行，无需凝胶、电泳或转膜步骤。磷酸化 c-Src Tyr（419）检测使用两种标记抗体：一种标记有供体荧光团，另一种标记有受体荧光团。第一种抗体经筛选可特异性结合蛋白质上的磷酸化基序，第二种抗体则能不依赖于蛋白质的磷酸化状态识别该蛋白质。蛋白质磷酸化会促使形成包含两种标记抗体的免疫复合物，使供体荧光团与受体荧光团靠近，从而产生 FRET 信号。信号强度与样品中磷酸化蛋白质的浓度直接成正比，且无需洗涤步骤即可评估蛋白质的磷酸化状态。

磷酸化 c-Src-Tyr（419）双板检测方案

双板方案包括：先在 96 孔板中培养细胞，裂解后将裂解物转移至 384 孔小体积检测板中，再加入磷酸化 c-Src-Tyr（419）HTRF 检测试剂。该方案能够监测细胞的活力和汇合度。

磷酸化 c-Src-Tyr（419）单板检测方案

使用 HTRF 试剂检测磷酸化 c-Src-Tyr（419）可在单个用于培养、刺激和裂解的板中进行，无需洗涤步骤。这种为高通量筛选（HTS）设计的方案能够实现微型化，同时保持稳定的 HTRF 质量。

检测验证

利用 siRNA 在 HEK293 细胞上对 c-Src 的 HTRF 检测进行验证

将人 HEK293 胚胎肾细胞接种并培养 24 小时。然后用 c-Src 小干扰 RNA 或阴性对照转染细胞，并用不同浓度的 H₂O₂处理，之后移除培养基并裂解细胞。将裂解物转移至 384 孔小体积白色微孔板中，并加入试剂盒试剂。与转染阴性对照小干扰 RNA 的细胞相比，用 c-Src 小干扰 RNA 处理的细胞的 HTRF 信号大幅降低（约 75%），这表明两种试剂盒均对 c-Src 具有特异性，且不会与其他 Src 家族成员发生交叉反应。

在 A431 癌细胞上使用磷酸化 c-Src 检测进行 HTRF 与蛋白质印迹法（WB）的比较

将人 A431 癌细胞接种在 T175 培养瓶中，培养至 80% 汇合度。细胞裂解后，通过离心收集可溶性上清液，在补充的裂解缓冲液中进行系列稀释，然后转移至 384 孔小体积白色微孔板中，最后加入 HTRF 磷酸化或总蛋白检测试剂。使用等量的裂解物进行蛋白质印迹法与 HTRF 的平行比较。HTRF 磷酸化 c-Src 检测的灵敏度是蛋白质印迹法的 32 倍，而总 c-Src 检测的灵敏度是蛋白质印迹法的 8 倍。

博舒替尼对 HEK293 细胞中 c-Src 活性的抑制作用

将 HEK293 细胞以每孔 100,000 个细胞的密度接种到 96 孔板中，在 37°C、5% CO₂条件下孵育 24 小时。用不同浓度的博舒替尼处理 30 分钟，然后用 20 mM H₂O₂刺激 10 分钟后，移除培养基，用 50 µL 补充的 3 号裂解缓冲液在室温下轻轻振荡裂解细胞 30 分钟。将 16 µL 裂解物转移至 384 孔小体积白色微孔板中，并加入 4 µL HTRF 磷酸化或总 c-Src 检测试剂。孵育 4 小时后记录 HTRF 信号。

使用 H₂O₂激活人 A431 表皮样癌细胞中的 c-Src

将 A431 细胞以每孔 100,000 个细胞的密度接种到 96 孔板中，在 37°C、5% CO₂条件下孵育 24 小时。用不同浓度的 H₂O₂处理 10 分钟后，移除培养基，用 50 µL 补充的 3 号裂解缓冲液在室温下轻轻振荡裂解细胞 30 分钟。将 16 µL 裂解物转移至 384 孔小体积白色微孔板中，并加入 4 µL HTRF 磷酸化或总 c-Src 检测试剂。孵育 4 小时后记录 HTRF 信号。

在其他人类癌细胞系上的验证

在经培养处理的 96 孔板中接种人 HepG2 肝细胞癌细、人 HeLa 宫颈癌细胞和人 MCF-7 乳腺癌细胞。孵育后，用 50 µL 补充的 3 号裂解缓冲液在室温下轻轻振荡裂解细胞 30 分钟。将 16 µL 裂解物转移至 384 孔小体积白色微孔板中，并加入 4 µL HTRF 磷酸化或总 c-Src 检测试剂。孵育 4 小时后记录 HTRF 信号。

经 H₂O₂处理的小鼠 NIH/3T3 细胞的细胞密度实验

将小鼠 NIH/3T3 胚胎成纤维细胞以不同的细胞密度接种到 96 孔板中，在 37°C、5% CO₂条件下孵育 24 小时。次日，用不同浓度的 H₂O₂处理细胞 10 分钟。然后移除培养基，用 50 µL 补充的 3 号裂解缓冲液在室温下轻轻振荡裂解细胞 30 分钟。将 16 µL 裂解物转移至 384 孔小体积白色微孔板中，并加入 4 µL HTRF 磷酸化或总 c-Src 检测试剂。孵育 4 小时后记录 HTRF 信号。

与经博舒替尼处理的 HEK293 细胞的 ELISA 检测结果的相关性

将 HEK293 细胞接种并培养 24 小时。用不同浓度的博舒替尼处理并经 H₂O₂刺激 10 分钟后，移除培养基，用 ELISA 或 HTRF 试剂盒试剂裂解细胞。对 HTRF 信号和比色 ELISA 信号进行测量。两种方法获得的博舒替尼的 IC50 值相近，表明 HTRF 与 ELISA 具有良好的相关性。

简化通路

c-Src 简化通路

c-Src 是一种膜相关的非受体蛋白酪氨酸激酶，在所有细胞类型中均有表达。当 Tyr530 位点发生磷酸化时，该激酶处于失活状态。Tyr530 去磷酸化后，Tyr419 发生自磷酸化，这是其完全激活的标志。c-Src 主要由受体酪氨酸激酶（RTKs）、整合素和活性氧（ROS）激活，是一种关键的信号中介，调控众多通路，如 AKT、MAPKs、STATs 和 NF-κB。它调控细胞增殖、分化、存活、形态、黏附和迁移。因此，Src 活性的精确调控对正常细胞生长至关重要。这种源于原癌基因的基因在许多人类癌症（如乳腺癌、结肠癌和胰腺癌）中存在过表达和高度激活的情况，使其成为癌症治疗的潜在靶点。

规格参数

其他规格参数

应用领域：细胞信号传导
品牌：HTRF
检测方式：HTRF
分子修饰：磷酸化
产品类别：试剂盒
样品体积：16 µL
运输条件：干冰运输
靶标类别：磷酸化蛋白
靶标物种：人、小鼠
技术：时间分辨荧光共振能量转移（TR-FRET）
治疗领域：肿瘤学与炎症
单位规格：50,000 个检测点

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货号：64SRCPEY

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