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概述

总 p53 细胞检测试剂盒可作为我们磷酸化 p53 试剂盒的归一化检测工具。p53 因在维护基因组完整性方面的作用而被称为 “基因组守护者”。它具有多种抗癌功能机制，通过调控各种靶基因的表达，影响细胞凋亡、衰老、细胞周期调控、生长停滞、基因组稳定性、血管生成抑制以及代谢变化。

工作原理

总 p53 检测原理

总 p53 检测可定量细胞裂解物中 p53 的表达水平。与蛋白质印迹法（Western Blot）不同，该检测完全基于微孔板进行，无需凝胶、电泳或转膜步骤。总 p53 检测使用两种标记抗体：一种偶联供体荧光团，另一种偶联受体荧光团。两种抗体都对 p53 蛋白上的特定表位具有高度特异性。当细胞提取物中存在 p53 时，加入这些偶联物会使供体荧光团与受体荧光团接近，从而产生荧光共振能量转移（FRET）信号。信号强度与样品中 p53 蛋白的浓度直接成正比，且该检测采用 “无需洗涤” 的形式，便于评估蛋白表达。

总 p53 双板检测方案

双板方案的流程为：先在 96 孔板中培养细胞，裂解后将裂解物转移至 384 孔低容量检测板，再加入总 p53 HTRF 检测试剂。该方案能够监测细胞活力和汇合度。

总 p53 单板检测方案

使用 HTRF 试剂检测总 p53 可在同一板中完成细胞培养、刺激和裂解步骤，无需洗涤。这种为高通量筛选（HTS）设计的方案支持实验微型化，同时保持稳定的 HTRF 检测质量。

检测验证

基于人 MCF-7 细胞的 HTRF 检测与蛋白质印迹法（WB）对比（使用磷酸化和总 p53 检测）

将人 MCF-7 细胞以 10⁶个细胞 / 孔的密度接种到 6 孔板中，在 37°C、5% CO₂条件下孵育 24 小时。经紫外线（2.1J/cm²）处理 5 分钟后，加入 200μL 裂解缓冲液，在室温下轻轻振荡裂解 30 分钟。用补充的裂解缓冲液对细胞裂解物进行系列稀释，取 16μL 各稀释液转移至 384 孔低容量白色微孔板中，再加入 4μL HTRF 磷酸化 p53（Ser15）检测试剂。使用等量的裂解物进行蛋白质印迹法与 HTRF 的平行对比。结果显示，两种 HTRF p53 检测的灵敏度至少是蛋白质印迹法的 4 倍。

新制癌菌素处理的 MCF-7 乳腺癌细胞总 p53 检测验证

将人 MCF-7 细胞以 100,000 个细胞 / 孔的密度接种到 96 孔板中，在 37°C、5% CO₂条件下孵育 24 小时。用不同浓度的新制癌菌素处理 45 分钟后，移除培养基，加入 50μL 裂解缓冲液，在室温下轻轻振荡裂解 30 分钟。取 16μL 裂解物转移至 384 孔低容量白色微孔板中，加入 4μL HTRF 磷酸化 p53（Ser15）或总 p53 检测试剂。孵育过夜后记录 HTRF 信号。

依托泊苷（凋亡诱导剂）处理的乳腺癌 MCF-7 细胞总 p53 检测验证

将人 MCF-7 细胞以 200,000 个细胞 / 孔的密度接种到 96 孔板中，在 37°C、5% CO₂条件下孵育 24 小时。用不同浓度的依托泊苷处理 3 小时后，移除培养基，加入 50μL 裂解缓冲液，在室温下轻轻振荡裂解 30 分钟。取 16μL 裂解物转移至 384 孔低容量白色微孔板中，加入 4μL HTRF 磷酸化 p53（Ser15）或总 p53 检测试剂。孵育过夜后记录 HTRF 信号。

简化通路

p53 的功能与调控

p53 可被多种应激源激活，包括但不限于 DNA 损伤、氧化应激、渗透压休克、核糖核苷酸耗竭和癌基因表达失调。在应对这些应激时，p53 会发生广泛的翻译后修饰，包括磷酸化和乙酰化。p53 的磷酸化主要发生在 N 端的 Ser15 位点，这会减弱 p53 与其负调控因子 —— 癌蛋白 MDM2 之间的相互作用。MDM2 通过靶向 p53 使其泛素化并经蛋白酶体降解，从而抑制 p53 的积累。该位点的磷酸化会削弱 MDM2 与 p53 的结合能力，促进 p53 在 DNA 损伤应答中的积累和激活。

规格

应用领域：细胞信号传导
品牌：HTRF
检测方式：HTRF
分子修饰：总蛋白
产品类别：试剂盒
样品体积：16μL
运输条件：干冰运输
靶标类别：磷蛋白
靶标物种：人
技术：时间分辨荧光共振能量转移（TR-FRET）
治疗领域：肿瘤学与炎症
单位规格：50,000 个检测点

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HTRF P53 TOTAL KIT - 50K PTS

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