HTRF ULK1 P-S758 KIT - 10K PTS

概述

这种基于细胞的磷酸化ULK1检测旨在监测ULK1在小鼠丝氨酸757（Ser757）或人类丝氨酸758（Ser758）位点的磷酸化水平变化。它是自噬（即细胞“自食”过程）的标志性事件。工作原理

磷酸化ULK1（小鼠Ser757/人类Ser758）检测原理 磷酸化ULK1（小鼠Ser757/人类Ser758）检测用于测量在小鼠Ser757或人类Ser758位点发生磷酸化的ULK1与蛋白质印迹法不同，该检测完全基于微孔板进行，无需凝胶、电泳或转膜步骤。此检测使用两种标记抗体：一种带有供体荧光团，另一种带有受体荧光团。第一种抗体经筛选可特异性结合蛋白质上的磷酸化基序，第二种抗体则能够不依赖蛋白质的磷酸化状态识别该蛋白质。蛋白质磷酸化会促使形成包含两种标记抗体的免疫复合物，使供体荧光团与受体荧光团接近，从而产生FRET（荧光共振能量转移）信号。信号强度与样品中磷酸化蛋白质的浓度直接成正比，且该检测采用“无需洗涤”的形式，为评估蛋白质的磷酸化状态提供了便利。 磷酸化ULK1（小鼠Ser757/人类Ser758）双板检测方案 双板方案包括：先在96孔板中培养细胞，然后裂解细胞，再将裂解物转移到384孔小体积检测板中，最后加入磷酸化ULK1 HTRF检测试剂。该方案能够监测细胞活力和汇合度。 磷酸化ULK1（小鼠Ser757/人类Ser758）单板检测方案 使用HTRF试剂检测磷酸化ULK1可在单个培养板中完成，该培养板同时用于细胞培养、刺激和裂解，无需洗涤步骤。这种为高通量筛选（HTS）设计的方案支持实验微型化，同时保持稳定的HTRF检测质量。检测验证

基于磷酸化ULK1细胞检测的HTRF检测与蛋白质印迹法的比较 将HEK293人胚肾细胞培养2天，直至达到80%汇合度。然后用补充的裂解缓冲液裂解细胞，通过离心收集可溶性上清液。用补充的裂解缓冲液对细胞裂解物进行系列稀释，将其转移到384孔小体积白色微孔板中，最后加入HTRF磷酸化ULK1试剂盒试剂。蛋白质印迹法与HTRF检测的平行比较表明，HTRF检测的灵敏度是蛋白质印迹法的4倍。 使用mTOR抑制剂Torin 1上调MCF-7人乳腺癌细胞中的自噬 将MCF-7细胞以100,000个细胞/孔的密度接种到96孔板中，在37°C、5%CO₂条件下孵育24小时。用不同浓度的Torin 1处理细胞5小时后，移除培养基，加入50µL补充的#4裂解缓冲液，在室温下轻轻振荡30分钟裂解细胞。将16µL裂解物转移到384孔小体积白色微孔板中，并加入4µL HTRF磷酸化ULK1（Ser758）检测试剂。室温孵育过夜后记录HTRF信号。 使用PI3K抑制剂渥曼青霉素上调HEK293人胚肾细胞中的自噬 将HEK293细胞以50,000个细胞/孔的密度接种到96孔板中，在37°C、5%CO₂条件下孵育24小时。用不同浓度的渥曼青霉素处理细胞5小时后，移除培养基，加入50µL补充的#4裂解缓冲液，在室温下轻轻振荡30分钟裂解细胞。将16µL裂解物转移到384孔小体积白色微孔板中，并加入4µL HTRF磷酸化ULK1（Ser758）检测试剂。室温孵育过夜后记录HTRF信号。 使用胰岛素下调MCF-7人乳腺癌细胞中的自噬 将MCF-7细胞以不同密度接种到96孔板中，在37°C、5%CO₂条件下孵育24小时。经过3小时的血清饥饿处理后，用200nM胰岛素处理细胞30分钟。然后移除培养基，加入50µL补充的#4裂解缓冲液，在室温下轻轻振荡30分钟裂解细胞。将16µL裂解物转移到384孔小体积白色微孔板中，并加入4µL HTRF磷酸化ULK1（Ser758）检测试剂。室温孵育过夜后记录HTRF信号。简化通路

ULK1激酶复合物的功能与调控 ULK1是一种丝氨酸/苏氨酸激酶，可与Atg13和FIP200蛋白形成复合物。该复合物是核心自噬机制中最上游的组件，因此是哺乳动物细胞自噬的关键启动因子。ULK1受关键的营养/能量敏感激酶mTOR和AMPK调控，这两种激酶均能磷酸化ULK1并直接调节其激酶活性。规格参数

其他规格 - 应用领域：细胞信号传导 - 品牌：HTRF - 检测方式：HTRF - 兼容的裂解缓冲液：裂解缓冲液1、裂解缓冲液3、裂解缓冲液4、裂解缓冲液5 - 分子修饰：磷酸化 - 产品类别：试剂盒 - 样品体积：16µL - 运输条件：干冰运输 - 靶标类别：磷酸化蛋白 - 靶标物种：人类 - 技术原理：TR-FRET - 治疗领域：心血管疾病、传染病、代谢/糖尿病、神经科学、肿瘤与炎症 - 单位规格：10,000个检测点