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HTRF YAP TOTAL KIT - 50K PTS

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概述

基于细胞的总 YAP 检测旨在监测 YAP 蛋白（包括磷酸化和非磷酸化形式）的表达水平。它使用与我们的磷酸化 YAP 试剂盒相同的缓冲液，能够从单个样品中分析磷酸化蛋白和总蛋白，从而更好地解读 Hippo-YAP 通路。YAP 作为 Hippo 通路的核心介导因子，是肿瘤疾病研究的重要靶点。

工作原理

总 YAP 检测原理

总 YAP 检测可定量细胞裂解物中 YAP 的表达水平。与蛋白质印迹法不同，该检测完全基于微孔板进行，无需凝胶、电泳或转膜步骤。总 YAP 检测使用两种标记抗体：一种偶联供体荧光团，另一种偶联受体荧光团。两种抗体都对该蛋白上的特定表位具有高度特异性。当细胞提取物中存在 YAP 时，添加这些偶联物会使供体荧光团与受体荧光团靠近，从而产生 FRET 信号。信号强度与样品中蛋白质的浓度直接成正比，并提供了一种在无需洗涤的检测格式下评估蛋白质表达的方法。

总 YAP 双板检测方案

双板方案包括先在 96 孔板中培养细胞，然后裂解，再将裂解物转移到 384 孔小体积检测板中，之后添加总 YAP HTRF 检测试剂。该方案能够监测细胞的活力和汇合度。

总 YAP 单板检测方案

使用 HTRF 试剂检测总 YAP 可在单个用于培养、刺激和裂解的板中进行。无需洗涤步骤。这种为高通量筛选（HTS）设计的方案能够实现小型化，同时保持稳定的 HTRF 质量。

检测验证

HTRF 总 YAP 检测与多种细胞系的兼容性

将人类细胞（HEK293、HEK293A、U-2 OS、HeLA、乳腺癌细胞、MCF 10A）和小鼠细胞（NIH 3T3）以每孔 100,000 个细胞的密度接种到 96 孔板中，使用去血清的细胞培养基，在 37°C、5% CO₂条件下孵育 24 小时。随后移除培养基，用 50 µL 裂解缓冲液在室温下轻轻振荡裂解细胞 30 分钟。将 16 µL 裂解物转移到 384 孔白色小体积微孔板中，并添加 4 µL HTRF 总 YAP（Ser127）检测试剂。孵育过夜后记录 HTRF 信号。

总 YAP 细胞检测中 HTRF 检测与蛋白质印迹法的比较

将人类乳腺癌细胞在 T175 培养瓶中于 37°C、5% CO₂条件下培养 48 小时。移除培养基后，用 3 mL 补充的裂解缓冲液在室温下裂解细胞 30 分钟。离心 10 分钟后收集可溶性组分。用补充的裂解缓冲液对细胞裂解物进行系列稀释，然后取 16 µL 各稀释液，分别通过蛋白质印迹法和 HTRF 进行平行分析。HTRF 总 YAP 检测的灵敏度是蛋白质印迹法的 2 倍。使用 HTRF 时，仅需 2,000 个细胞即可检测到最低信号，而蛋白质印迹法则需要 4,000 个细胞才能产生信号。

血清刺激对总 YAP 的动力学影响

将 100,000 个 HEK293A 细胞接种到 96 孔板中，使用去血清的细胞培养基，在 37°C、5% CO₂条件下孵育 24 小时。加入血清并分别刺激不同时间后，移除细胞培养基，用 50 µL 裂解缓冲液在室温下轻轻振荡裂解细胞 30 分钟。将 16 µL 裂解物转移到 384 孔白色小体积微孔板中，并添加 4 µL HTRF 总 YAP 检测试剂。孵育过夜后记录 HTRF 信号。结果显示，需要将细胞暴露于血清中过夜才能获得最佳量的总 YAP 蛋白。

简化通路

Hippo-YAP 细胞信号激活通路

Hippo/YAP 通路通过调控细胞增殖与凋亡之间的平衡来调节器官大小，还参与机械信号和细胞骨架信号的转导。该通路可被多种刺激激活，如细胞黏附、高细胞密度、机械张力或缺乏生长因子等。通路激活后，首先激活 MTS 激酶，进而磷酸化 Lats 激酶。随后，YAP 在丝氨酸 127 位点被磷酸化，导致其滞留于细胞质中，最终被蛋白酶体降解。因此，磷酸化的 YAP 代表该蛋白质的失活形式。已有研究报道，在某些类型的癌症（如乳腺癌、肺癌、卵巢癌和结肠癌）中存在 YAP/TAZ 突变。

Hippo-YAP 细胞信号失活通路

Hippo/YAP 通路通过调控细胞增殖与凋亡之间的平衡来调节器官大小，此外还参与机械信号和细胞骨架信号的转导。当 Hippo/YAP 通路失活时，YAP/TAZ 在细胞核内积累，并诱导参与细胞增殖的基因转录。除了其自身特性和癌基因潜能外，Hippo/Yap 通路中的某些突变会导致过度生长表型，这在器官大小上可体现出来。最后，Hippo/yap 通路的失调会赋予癌细胞自我再生的特性（Cordenonsi 等人，《细胞》2011 年；Pan D 等人，《基因与发育》2007 年；Pan D 等人，《发育细胞》2010 年）。

规格参数

应用领域：细胞信号传导
品牌：HTRF
检测方式：HTRF
分子修饰：总（蛋白）
产品类别：试剂盒
样品体积：16 µL
运输条件：干冰运输
靶标类别：磷酸化蛋白
靶标物种：人、小鼠
技术原理：时间分辨荧光共振能量转移（TR-FRET）
治疗领域：非酒精性脂肪性肝炎 / 纤维化（NASH/Fibrosis）
单位规格：50,000 个检测点

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货号：64YATPEY

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