产品概述

β 淀粉样蛋白 1-40（Amyloid β1-40）和 β 淀粉样蛋白 1-42（ß1-42）肽与阿尔茨海默病症状的出现相关。这两种淀粉样肽的产生受 β 分泌酶和 γ 分泌酶的活性调控，这两种酶会切割淀粉样前体蛋白（APP）。本试剂盒用于检测细胞上清液或全细胞中的 β 淀粉样蛋白 1-42 肽，凭借 “添加即检测”（Add and Read）的简便操作流程，成为酶联免疫吸附试验（ELISA）的快速替代方案。

工作原理

检测原理

人源 β 淀粉样蛋白 1-42 检测可定量细胞、组织上清液或裂解液中的人源 β 淀粉样蛋白 1-42 肽。检测采用两种标记抗体：一种偶联供体荧光团，另一种偶联受体荧光团。两种抗体均对人源 β 淀粉样蛋白 1-42 肽上的不同表位具有高特异性。当细胞提取物中存在人源 β 淀粉样蛋白 1-42 肽时，加入这些抗体偶联物会使供体荧光团与受体荧光团靠近，进而产生荧光共振能量转移（FRET）信号。信号强度与样本中目标蛋白的浓度直接成正比，且在无洗涤检测格式下，可评估实验变异性引起的任何变化。（标注：biomarkers-how-it-works-assay-principle-human-amyloid-b 为图表 / 文件标识，可译为 “生物标志物 - 人源 β 淀粉样蛋白 1-42 检测原理”）

检测方案

人源 β 淀粉样蛋白 1-42 试剂盒采用双板检测方案：细胞在同一培养板中接种、刺激，必要时进行裂解。随后将细胞上清液和 / 或裂解液转移至检测板中，进行人源 β 淀粉样蛋白 1-42 检测。该方案可同步监测细胞的存活率和汇合度。标记 HTRF 荧光团的抗体可预先混合，通过单次加样步骤加入，进一步简化检测流程。仅需按比例调整各试剂的添加体积，检测即可在 96 孔至 384 孔板中进行。（标注：biomarkers-how-it-works-assay-protocol-human-amyloid-b 为图表 / 文件标识，可译为 “生物标志物 - 人源 β 淀粉样蛋白 1-42 检测方案”）

检测详情

• 样本量：16 µL
• 最终检测体积：20 µL
• 出结果时间：室温过夜（Overnight at RT）
• 检测限：9 pg/mL
• 动态范围：40–2000 pg/mL
• 样本兼容性：细胞上清液、细胞裂解液（1 号裂解缓冲液，LB#1）

（标注：assay-validation-human-amyloid-b-1 为图表 / 文件标识，可译为 “人源 β 淀粉样蛋白 1-42 检测验证 1”）

分析性能

精密度

批内精密度（n=24）

• 每个样本检测 24 次，计算各样本的变异系数（% CV）
• 样本 1：β 淀粉样蛋白 1-42 均值 200 pg/mL，变异系数（CV）6%
• 样本 2：β 淀粉样蛋白 1-42 均值 800 pg/mL，变异系数（CV）4%
• 样本 3：β 淀粉样蛋白 1-42 均值 1500 pg/mL，变异系数（CV）3%

批间精密度（n=4）

• 每个样本由 4 名不同操作者在 4 个独立实验中检测，计算各样本的变异系数（% CV）
• 样本 1：β 淀粉样蛋白 1-42 均值 192 pg/mL，变异系数（CV）2.30%
• 样本 2：β 淀粉样蛋白 1-42 均值 341 pg/mL，变异系数（CV）1.90%
• 样本 3：β 淀粉样蛋白 1-42 均值 1109 pg/mL，变异系数（CV）0.50%

抗原加标回收

• 实验设计：向 HEK293 APPsw 细胞上清液的两种重组蛋白水平（400 pg/mL 和 850 pg/mL）中，加入 3 种浓度的天然样本，通过比较预期浓度与实测浓度计算抗原回收率
• 样本 1：标准 β 淀粉样蛋白 1-42 850 pg/mL，添加天然 β 淀粉样蛋白 1-42 1164 pg/mL，预期浓度 1007 pg/mL，实测浓度 1212 pg/mL，回收率 120%
• 样本 2：标准 β 淀粉样蛋白 1-42 850 pg/mL，添加天然 β 淀粉样蛋白 1-42 2200 pg/mL，预期浓度 1525 pg/mL，实测浓度 1742 pg/mL，回收率 114%
• 样本 3：标准 β 淀粉样蛋白 1-42 850 pg/mL，添加天然 β 淀粉样蛋白 1-42 4140 pg/mL，预期浓度 2495 pg/mL，实测浓度 2703 pg/mL，回收率 108%
• 样本 4：标准 β 淀粉样蛋白 1-42 400 pg/mL，添加天然 β 淀粉样蛋白 1-42 1164 pg/mL，预期浓度 782 pg/mL，实测浓度 908 pg/mL，回收率 116%
• 样本 5：标准 β 淀粉样蛋白 1-42 400 pg/mL，添加天然 β 淀粉样蛋白 1-42 2200 pg/mL，预期浓度 1300 pg/mL，实测浓度 1405 pg/mL，回收率 108%
• 样本 6：标准 β 淀粉样蛋白 1-42 400 pg/mL，添加天然 β 淀粉样蛋白 1-42 4140 pg/mL，预期浓度 2270 pg/mL，实测浓度 2256 pg/mL，回收率 99%

稀释线性

• 实验条件：在常规微量离心管中进行稀释实验，低结合微量离心管未显示稀释线性有显著变化（数据未展示）；样本为秀丽隐杆线虫细胞提取物，用试剂盒稀释液 DIL5 稀释
• 稀释倍数 1（原液）：预期浓度 569.29 pg/mL，实测浓度 569.29 pg/mL，回收率 100%
• 稀释倍数 2：预期浓度 284.65 pg/mL，实测浓度 278.93 pg/mL，回收率 98%
• 稀释倍数 4：预期浓度 142.32 pg/mL，实测浓度 128.00 pg/mL，回收率 90%
• 稀释倍数 8：预期浓度 71.16 pg/mL，实测浓度 77.72 pg/mL，回收率 109%
• 稀释倍数 16：预期浓度 35.58 pg/mL，实测浓度 34.04 pg/mL，回收率 96%
• 稀释倍数 32：预期浓度 17.79 pg/mL，实测浓度 15.65 pg/mL，回收率 88%
• 实验结果：回收率数据显示该检测具有良好的稀释线性

交叉反应与干扰

• 实验方法：交叉反应通过在试剂盒稀释液中制备重组肽标准曲线（浓度 60–2000 pg/mL）确定；干扰实验通过向含 350 pg/mL β 淀粉样蛋白 1-42 肽的样本中，添加 6 种递增浓度的肽（125–4000 pg/mL）进行检测
• β 淀粉样蛋白 1-42：反应性 100%，无干扰
• β 淀粉样蛋白 3-42：反应性约 40%，无干扰
• β 淀粉样蛋白 1-38：无反应性，无干扰
• β 淀粉样蛋白 1-43：无反应性，无干扰
• β 淀粉样蛋白 17-42：无反应性，无干扰
• β 淀粉样蛋白 1-40：无反应性，干扰约 20%
• 淀粉样前体蛋白 770（APP770）：无反应性，无干扰

检测验证

过表达瑞典突变型 APP 的 SH-SY5Y 细胞分泌 β 淀粉样蛋白 1-42

人源 SH-SY5Y APPsw 样本由法国尼斯 CNRS-UMR 7275 分子与药理学研究所的 Chami Mounia 博士制备。稳定表达携带瑞典双突变（K670N/M671L；APPswe）淀粉样前体蛋白的神经母细胞瘤细胞（CRL-2266；美国典型培养物保藏中心），按标准方案构建（Oules 等人，2012 [1]），并在添加 10% 胎牛血清和青霉素 / 链霉素的 DMEM 培养基中培养，同时添加 400 μg 遗传霉素。细胞上清液中加入蛋白酶抑制剂混合物，于 - 80°C 保存至检测。对每个样本进行多种稀释，以确定最合适的条件，在最小化稀释偏差的同时保持在检测的线性范围内。按照 HTRF 试剂盒说明书流程，取 16 µL 上清液，在人源 β 淀粉样蛋白 1-40 和 1-42 HTRF 试剂盒中进行三重检测。结果显示，该稳定表达瑞典双突变的细胞系，其淀粉样肽浓度极高（超过 10,000 pg/mL），已知该突变会导致 APP 大量裂解产生淀粉样肽。[1] Oules, B., D. Del Prete, B. Greco, X. Zhang, I. Lauritzen, J. Sevalle, S. Moreno, P. Paterlini-Brechot, M. Trebak, F. Checler, F. Benfenati & M. Chami (2012) Ryanodine receptor blockade reduces amyloid-beta load and memory impairments in Tg2576 mouse model of Alzheimer Disease. J Neurosci, 32, 11820-34.（标注：assay-validation-human-amyloid-b-2 为图表 / 文件标识，可译为 “人源 β 淀粉样蛋白 1-42 检测验证 2”）

过表达瑞典突变型 APP 的 HEK293 细胞分泌 β 淀粉样蛋白 1-42

人源 HEK293 APPsw 细胞以 660,000 个细胞 /mL 的密度接种到培养瓶中，在添加 10% 胎牛血清的 DMEM 培养基中培养 48 小时。细胞上清液中加入蛋白酶抑制剂混合物以防止淀粉样肽降解，随后于 - 80°C 保存至检测。对每个样本进行多种稀释，以确定最合适的条件，在最小化稀释偏差的同时保持在检测的线性范围内。按照 HTRF 试剂盒说明书流程，取 16 µL 上清液，在人源 β 淀粉样蛋白 1-40 和 1-42 HTRF 试剂盒中进行三重检测。结果显示，该稳定表达瑞典突变的细胞系，其淀粉样肽浓度较高，已知该突变会导致 APP 大量裂解产生淀粉样肽。（标注：Assay-validation-human-amyloid-b-3 为图表 / 文件标识，可译为 “人源 β 淀粉样蛋白 1-42 检测验证 3”）

简化通路

神经元细胞中淀粉样肽的分泌

β 淀粉样蛋白 1-40 和 1-42 肽与阿尔茨海默病症状的出现相关，其产生受 β 分泌酶和 γ 分泌酶的活性调控，这两种酶会切割淀粉样前体蛋白（APP）。正常情况下，APP 通过非淀粉样生成途径加工，α 分泌酶切割产生可溶性 APP，参与正常神经元功能。但在病理状态下，APP 会被 β 分泌酶异常切割，随后经 γ 分泌酶切割释放易聚集的淀粉样肽。这种淀粉样生成途径会导致斑块形成，损害神经元功能，并可能引发神经退行性病变。在阿尔茨海默病细胞模型中，检测分泌型 β 淀粉样肽对评估淀粉样生成途径的活性至关重要。（术语注释：CTFa/b：α/β 羧基端片段；APP：淀粉样前体蛋白；ICD：APP 细胞内结构域；P3：P3 蛋白 =β 淀粉样蛋白 17-42（非淀粉样生成型））（标注：Amyloidogenic simplified pathway、biomarkers-simplified-pathway-human-amyloid-b-62b42peg 为图表 / 文件标识，可译为 “淀粉样生成简化通路”“生物标志物 - 人源 β 淀粉样蛋白简化通路”）

产品规格

其他规格

• 应用领域：Protein Quantification（蛋白定量）
• 品牌：HTRF
• 检测方式：HTRF（均相时间分辨荧光）
• 产品类别：Kit（试剂盒）
• 样本体积：16 µL
• 运输条件：干冰运输（Shipped in Dry Ice）
• 靶标类别：Biomarkers（生物标志物）
• 靶标物种：人（Human）
• 技术平台：TR-FRET（时间分辨荧光共振能量转移）
• 单位规格：100,000 次检测（100,000 assay points）