产品概述

清除受损线粒体对维持细胞稳态至关重要。线粒体外膜转运酶（TOM）受体复合物负责介导蛋白质穿过线粒体外膜进入膜间隙，而 TOM20 是该复合物的核心组分。监测 TOM20 的降解水平是线粒体自噬激活的重要指标。本试剂盒适用于定量细胞裂解液中的 TOM20，采用 “添加 - 读数”（Add and Read）方法，操作简便，是酶联免疫吸附试验（ELISA）的快速替代方案。

工作原理

检测原理

TOM20 的检测采用夹心免疫分析技术，涉及两种特异性抗 TOM20 抗体，分别标记 HTRF 供体染料和受体染料。检测信号强度与样本中 TOM20 的浓度直接成正比。（标注：Assay principle human mouse 为图表标识，对应 “人 / 鼠 TOM20 检测原理”）

检测流程

采用双板实验方案：细胞在 96 孔板中培养后裂解，随后将裂解液转移至 384 孔低体积检测板，加入 TOM20 HTRF 检测试剂。该方案可监测细胞活力与汇合度。（标注：Assay human mouse tom 为图表标识，对应 “人 / 鼠 TOM20 检测流程”）

分析性能

核心检测参数

• 出结果时间：室温下过夜（ON at RT）
• 检测限（LOD）与定量限（LOQ）（稀释液中）：25 pg/mL 和 45 pg/mL
• 检测范围：45–5000 pg/mL

检测精密度

批内精密度（n=24）

• 样本 1：平均 TOM20 浓度 109 pg/mL，变异系数（CV）5.5%
• 样本 2：平均 TOM20 浓度 590 pg/mL，CV 1.9%
• 样本 3：平均 TOM20 浓度 2048 pg/mL，CV 2.1%
• 平均 CV：3.7%注：3 个样本各检测 24 次，计算每个样本浓度的 CV 值。

批间精密度（n=4）

• 样本 1：TOM20 浓度 156 pg/mL，平均 delta R 值 588，CV 11%
• 样本 2：TOM20 浓度 625 pg/mL，平均 delta R 值 3604，CV 5%
• 样本 3：TOM20 浓度 2500 pg/mL，平均 delta R 值 17989，CV 9%
• 平均 CV：6%注：每个样本在 4 个独立实验中检测，计算每个样本浓度的 CV 值。

检测验证

缬氨霉素诱导人 SH-SY5Y 细胞系的线粒体自噬检测

将人神经母细胞瘤 SH-SY5Y 细胞以 50,000 个细胞 / 孔接种于 96 孔板，使用完全培养基（DMEM/F-12、10 mM HEPES + 10% 胎牛血清）在 37°C、5% CO₂条件下过夜培养。次日更换培养基，加入不同浓度的线粒体解偶联剂缬氨霉素，在 37°C、5% CO₂条件下孵育 24 小时。移除培养基后，加入 50 µL 1X 补充型 #4 裂解缓冲液，室温温和振荡裂解 30 分钟，取 16 µL 裂解液转移至低体积白色微孔板，加入 4 µL HTRF TOM20 检测抗体，室温过夜孵育后记录 HTRF 信号，根据 TOM20 标准品系列稀释建立的校准曲线对信号进行插值计算。同时，取 14 µL 裂解液进行 HTRF 泛素磷酸化 - S65 检测，作为缬氨霉素介导线粒体自噬激活的对照。（标注：Human mouse tom、Assay validation human mouse tom 为图表标识，对应 “SH-SY5Y 细胞线粒体自噬检测结果”）

简化通路

线粒体自噬简化通路

在线粒体去极化诱导的自噬过程中，结合于线粒体外膜的 PTEN 诱导激酶 1（PINK1）通过二聚化和自身磷酸化激活。激活后的 PINK1 可磷酸化泛素连接酶帕金（Parkin）的泛素样结构域 Ser65 位点，同时也能磷酸化线粒体外膜上的泛素化蛋白（包括 TOM20）。TOM20 泛素化后会被转运至蛋白酶体降解，最终导致磷酸化泛素浓度升高，而 TOM20 浓度降低。（标注：Simplified pathway tom 为图表标识，对应 “线粒体自噬简化通路”）

产品规格

• 应用领域：蛋白定量（Protein Quantification）
• 自动化兼容性：是（Yes）
• 品牌：HTRF
• 检测方式：HTRF（均相时间分辨荧光）
• 裂解缓冲液兼容性：#1 裂解缓冲液、#4 裂解缓冲液
• 产品类别：试剂盒（Kit）
• 样本体积：16 µL
• 运输条件：干冰运输（Shipped in Dry Ice）
• 靶标类别：生物标志物（Biomarkers）
• 靶标物种：人（Human）、鼠（Mouse）
• 技术平台：TR-FRET（时间分辨荧光共振能量转移）
• 治疗领域：肿瘤学与炎症（Oncology & Inflammation）
• 单位规格：500 次检测（500 assay points）