FAQ ：瑞孚迪pHSence Eu探针-ADC 内化检测，产品及检测篇

ADC 内化检测


产品及检测篇 Q&A

5. Q: Fab 探针是单抗还是多抗？
A: pHsence Eu 的 Fab 是多克隆抗体。因此 Fc 片段可能有多个表位被识别，若抗体存在点突 变、 Fc 端修饰，理论上来说不用担心 Fab 的结合。但为了确保万无一失，客户需要进行测试 来确认这一点。
6. Q: pHsense Eu Fab anti-human IgG Fab 的分子量？
A: ~ 50KDa
7. Q：探针 PKa 是多少？
A: pH~6
8. Q: pHsense Eu 探针的效期？
A: 12 months (pHSense Eu Fab anti-Human lgG； pHSense Eu Fab anti-mouse IgG2)

9. Q：抗体/ADC 和探针孵育时该注意什么？

A: Dose response assay 中，建议以最高浓度点与 pHsense Fab-Eu 孵育（室温孵育 30min）， 后梯度稀释。

10. Q：仪器参数如何设置？

A: 可参照《pHSense™ setup recommendations for Revvity microplate readers》进行参数设置。

大多数情况下酶标仪 TRF 模式按推荐参数设置可以满足检测需求。因选用的抗体、浓度及培养 体系不同， Delay 时间可以适当延长以减少非特异性信号。

11. Q: 如何分析待测样本探针信号随孵育时间增加而增强？

A: 实验孔探针信号增强主要来自两个方面： 信号随内吞量增加而增强； 信号随内吞进展 pH 降 低而增强。另外，若长时间培养，培养基酸化会导致背景信号增加， 因此，对于不同浓度的待 测抗体均需设置对应的 Fab only 对照，以便扣除背景得到特异性信号。

12. Q: 能判断内吞不同阶段吗？

A: 不能。信号来自整个孔当中，所有细胞上抗体不同内吞阶段的 mix。后续将推出仅在晚期内 体及溶酶体中特异发光的探针。

13. Q: 探针会透膜自发进入细胞内吗？

A: 不会自发透膜。可通过 Fab only 组扣除背景。

14. Q: 探针被内吞进入溶酶体中后会被排出造成信号降低吗？

A: 探针的荧光强度与 pH 值有关。如果探针被排泄到比溶酶体酸性更小的腔室中， 将观察到信 号的减少。

15. Q: 若细胞数量少，细胞在每个孔的位置不一致，会影响结果吗？

A: 酶标仪为单孔多点数据， 能避免位置因素影响。另外，建议均匀种板。

16. Q: 多次读数会有污染风险， 怎么解决？

A: 读数前可使用静电吸附膜贴膜（推荐货号： 64TOPSAPRO-50，免撕透光， 兼容 TRF 检测）。 17. Q: 贴壁细胞可以不用贴壁过夜，直接加探针抗体混合物孵育后检测吗？

A: 通常贴壁细胞需要过夜贴壁以维持正常的生理状态。若通过对比实验，确定贴壁细胞悬浮状 态不影响细胞抗原表达及内吞状态， 就可以直接添加探针抗体混合物。

18. Q: 有无做过血清容忍度测试？高血清检测是否会影响数据？

A: 一般细胞培养的血清含量(小于等于 20%) 不会对实验结果产生影响。且在相同培养基质中获

得的数据是完全可以比较的。