自噬相关 16 样蛋白 1（ATG16L1）是一种自噬必需蛋白。ATG16L1 会被募集到吞噬泡，并将 ATG5-ATG12 复合物募集至吞噬泡，从而促进 LC3 脂化（从 LC3-I 向 LC3-II 转化），并有助于自噬体的成熟。
丝氨酸 278（Ser278）位点磷酸化的 ATG16L1 仅存在于新形成的自噬体上，因此对其进行定量可作为自噬囊泡形成和自噬诱导的理想替代指标。ATG16L1 与阿尔茨海默病、结直肠癌、心脏病、乳腺癌和慢性髓系白血病等疾病相关。
HTRF 总 ATG16L1 检测用于定量细胞裂解物中 ATG16L1 的表达水平。与蛋白质印迹法（Western Blot）不同，该检测完全基于微孔板进行，无需凝胶、电泳或转膜步骤。HTRF 总 ATG16L1 检测采用两种标记抗体：一种偶联供体荧光团，另一种偶联受体荧光团。两种抗体均对该蛋白质上的特定表位具有高度特异性。当细胞提取物中存在 ATG16L1 时，加入这些偶联物会使供体荧光团与受体荧光团靠近，从而产生 FRET 信号。信号强度与样品中蛋白质的浓度直接成正比，为在免洗涤检测格式中评估蛋白质表达水平提供了手段。
1phospho-how-it-works-atg14-total-assay-principle.svg（示意图）
双板方案包括：先在 96 孔板中培养细胞，然后裂解细胞，再将裂解物转移至低体积检测板（可为 HTRF 384 孔低体积板或 96 孔低体积板），最后加入 HTRF 总 ATG16L1 检测试剂。该方案能够监测细胞的活力和汇合度。
HTRF 总 BRD2 检测的双板方案
使用 HTRF 试剂检测总 ATG16L1 可在单个培养板中完成，该培养板同时用于细胞培养、刺激和裂解。无需洗涤步骤。这种为高通量筛选（HTS）设计的方案可实现小型化，同时保持稳定的 HTRF 检测质量。
HTRF 总 BRD2 检测的单板方案
将人 U-87 MG 细胞以 100,000 个细胞 / 孔的密度接种到 96 孔板中，使用完全培养基，在 37°C、5% CO₂条件下孵育过夜。用 mTOR 抑制剂 AZD2014 的浓度梯度处理细胞 3 小时（37°C、5% CO₂）。移除培养基后，加入 25 µl 补充的 3 号裂解缓冲液（1X）+ BR（2X），在室温下轻轻振荡 1 小时裂解细胞。细胞裂解后，将 16 µL 裂解物转移至 384 孔低体积白色微孔板中，再加入 4 µL HTRF 磷酸化 ATG16L1（Ser278）或总 ATG16L1 检测试剂。室温孵育过夜后记录两种试剂盒的 HTRF 信号。如预期所示，强效 mTOR 抑制剂 AZD2014 会诱导自噬激活，导致 ATG16L1 的 Ser278 位点磷酸化呈剂量依赖性增加，而对总 ATG16L1 蛋白的表达水平无显著影响。
将人 U-87 MG 细胞以 100,000 个细胞 / 孔的密度接种到 96 孔板中，使用完全培养基，在 37°C、5% CO₂条件下孵育过夜。用 2.5 µM 的 mTOR 抑制剂 AZD2014 和自噬激酶 ULK1/2 抑制剂 ULK-101 的浓度梯度处理细胞 3 小时（37°C、5% CO₂）。移除培养基后，加入 25 µl 补充的 3 号裂解缓冲液（1X）+ BR（2X），在室温下轻轻振荡 1 小时裂解细胞。细胞裂解后，将 16 µL 裂解物转移至 384 孔低体积白色微孔板中，再加入 4 µL HTRF 磷酸化 ATG16L1（Ser278）或总 ATG16L1 检测试剂。室温孵育过夜后记录两种试剂盒的 HTRF 信号。如预期所示，强效双重自噬激酶 ULK1/2 抑制剂 ULK-101 会抑制 AZD2014 诱导的自噬激活，导致 ATG16L1 的 Ser278 位点磷酸化呈剂量依赖性降低，而对总 ATG16L1 蛋白的表达水平无显著影响。
2assay-validation-phospho-ser278-atg16l1-2-64atg16s8peg-64atg16s8peh-64atg16s8pef.svg（验证示意图 2）
3assay-validation-phospho-ser278-atg16l1-3-64atg16s8peg-64atg16s8peh-64atg16s8pef.svg（验证示意图 3）
使用 HTRF 总 ATG16L1 试剂盒评估野生型（WT）和 ATG16 敲除（KO）HAP1 细胞中人总 ATG16L1 的表达水平。将细胞系在培养瓶中培养，在 37°C、5% CO₂条件下孵育 48 小时。移除培养基后，加入补充的 3 号裂解缓冲液（1X）+ BR（2X），在室温下轻轻振荡 30 分钟裂解细胞。细胞裂解后，将 16 µL 裂解物转移至 384 孔低体积白色微孔板中，再加入 4 µL HTRF 总 ATG16L1 检测试剂。同时，使用 GAPDH 管家基因细胞检测试剂盒（# 64GAPDHPET/G/H）监测 GAPDH 水平：将 4 µL 细胞裂解物用 180 µL 11 号稀释剂预稀释，然后将 16 µL 稀释后的样品与 4 µL HTRF GAPDH 管家基因细胞检测试剂混合。室温孵育过夜后记录两种试剂盒的 HTRF 信号。在两种测试条件下，测得的 GAPDH 水平相当。相比之下，HAP1 野生型细胞中 HTRF 总 ATG16L1 信号显著为阳性，而 HAP1 ATG16 敲除细胞中该信号大幅降低（与阴性信号相当），这证明了 HTRF 总 ATG16L1 检测对 ATG16L1 蛋白检测的特异性。HAP1 ATG16 敲除（10bp 缺失）细胞系来自 Horizon Discovery # HZGHC000296c010，HAP1 野生型细胞系来自 Horizon Discovery # C631。
4assay-validation-phospho-ser278-atg16l1-specificity-64atg16s8peg-64atg16s8peh-64atg16s8pef.svg（特异性
