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HTRF (H/M) RAB10 P-T73 KIT - 50K PTS

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概述

RAS 相关蛋白 Rab10（RAB10）属于小 GTP 酶的 RAS 超家族。RAB10 通过调控膜结合细胞器和囊泡的生物发生、运输、锚定和融合，是细胞内膜运输的关键调节因子。LRRK2 介导的磷酸化可能导致由 RAB10 调控的内溶酶体运输通路出现缺陷，进而促成神经退行性疾病的发生。RAB10 与阿尔茨海默病和帕金森病相关。

工作原理

HTRF 磷酸化 RAB10 检测原理

磷酸化 RAB10（Thr73）检测用于测量苏氨酸 73（Threonine 73）位点磷酸化的 RAB10。与蛋白质印迹法（Western Blot）不同，该检测完全基于微孔板进行，无需凝胶、电泳或转膜步骤。

磷酸化 RAB10（Thr73）检测使用两种标记抗体：一种标记供体荧光团，另一种标记受体荧光团。第一种抗体经筛选可特异性结合蛋白质上的磷酸化基序，第二种抗体则能不依赖于蛋白质的磷酸化状态识别该蛋白质。蛋白质磷酸化会促使形成包含两种标记抗体的免疫复合物，使供体荧光团与受体荧光团靠近，从而产生 FRET 信号。信号强度与样品中磷酸化蛋白质的浓度直接成正比，且无需洗涤步骤即可评估蛋白质的磷酸化状态。

HTRF 磷酸化 RAB10 Thr73 双板检测方案

双板方案包括：先在 96 孔板中培养细胞，裂解后将裂解物转移至 384 孔小体积检测板中，再加入磷酸化 RAB10 Thr73 HTRF 检测试剂。

该方案能够监测细胞的活力和汇合度。

HTRF 磷酸化 RAB10 Thr73 单板检测方案

使用 HTRF 试剂检测磷酸化 RAB10 Thr73 可在单个用于培养、刺激和裂解的板中进行，无需洗涤步骤。

这种为高通量筛选（HTS）设计的方案能够实现微型化，同时保持稳定的 HTRF 质量。

检测验证

A549 和 Raw264.7 细胞系中磷酸化 RAB10-Thr73 的抑制作用

将 A549 和 Raw264.7 细胞以 200,000 个细胞 / 孔的密度接种到 96 孔培养处理板中，使用完全培养基，在 37°C、5% CO₂条件下过夜孵育。然后用不同浓度的 MLi-2 处理细胞 1 小时 30 分钟（37°C、5% CO₂），随后用 100 µM 的氯喹刺激 3 小时。

细胞裂解后，将 16 µL 裂解物转移至 384 孔小体积白色微孔板中，然后加入 4 µL HTRF 磷酸化（Thr73）检测试剂以检测磷酸化蛋白水平。同时，将 4 µL 裂解物（补充 8 µL 裂解缓冲液）也转移至微孔板中，先加入 2 µL HTRF 磷酸化与总激活试剂 A、2 µL HTRF 磷酸化与总激活试剂 B，再加入 4 µL 总 RAB10 检测试剂以检测总 RAB10 蛋白。在室温下过夜孵育后记录 HTRF 信号。

如预期所示，结果显示用 MLi-2 处理后，RAB10 Thr73 的磷酸化呈剂量反应性抑制，而 RAB10 的表达水平保持恒定。

小干扰 RNA（siRNA）对磷酸化 RAB10-Thr73 的下调作用

将 A549 细胞接种到 96 孔板中（100,000 个细胞 / 孔），培养 24 小时。然后用针对 RAB10 的特异性 siRNA 以及阴性对照 siRNA 转染细胞。孵育 48 小时后，用 500 µM 氯喹刺激细胞 5 小时，然后用补充的裂解缓冲液裂解细胞。将 16 µL 裂解物转移至 384 孔小体积白色微孔板中，然后加入 4 µL HTRF 磷酸化 RAB10（Thr73）检测抗体。另外，将 4 µL 裂解物（补充 12 µL 稀释剂 #11）转移至微孔板中，使用 GAPDH 管家细胞试剂盒（64GAPDHPET/G/H）监测 GAPDH 水平。过夜孵育后记录两个试剂盒的 HTRF 信号。

与转染阴性 siRNA 的细胞相比，转染 RAB10 siRNA 的细胞信号降低了 64%。在所有测试条件下，所测 GAPDH 水平保持不变。这些数据表明 HTRF 磷酸化 RAB10（Thr73）试剂盒对磷酸化 RAB10 蛋白的检测具有特异性。

多种细胞系中磷酸化 RAB10（Thr73）的检测

将 A549、1321-N1 和 Raw264.7 细胞以 200,000 个细胞 / 孔的密度接种到 96 孔微孔板中。孵育 24 小时后，用或不用 500 µM 氯喹刺激细胞 5 小时，然后用补充的裂解缓冲液裂解细胞。接下来，将 16 µL 裂解物转移至 384 孔小体积白色微孔板中，然后加入 4 µL HTRF 磷酸化 RAB10（Thr73）检测试剂。过夜孵育后记录 HTRF 信号。

HTRF 磷酸化 Rab10（Thr73）检测能有效检测经氯喹刺激或未刺激的各种细胞模型中的磷酸化 RAB10（Thr73）。

HTRF 磷酸化 RAB10-Thr73 检测与蛋白质印迹法的比较

将 A549 细胞在 T175 培养瓶中的完全培养基中培养（37°C、5% CO₂）。孵育 72 小时后，用氯喹刺激细胞 5 小时，然后用 3 mL 补充的 1X 3 号裂解缓冲液在室温下轻轻振荡裂解 30 分钟。

用补充的裂解缓冲液对细胞裂解物进行系列稀释，将 16 µL 各稀释液转移至小体积白色微孔板中，然后加入 4 µL HTRF 磷酸化 RAB10（Thr73）检测试剂。使用等量的裂解物进行 HTRF 与蛋白质印迹法的平行比较。

蛋白质印迹法与 HTRF 的平行比较表明，至少在这些实验条件下，HTRF 检测的灵敏度是蛋白质印迹法的 8 倍。

简化通路

简化的 RAB10 信号通路

富含亮氨酸重复序列激酶 2（LRRK2）是常染色体显性帕金森病的主要致病基因，它是一种蛋白激酶，可磷酸化包括 RAB10 在内的一部分 RAB GTP 酶。RAB29 介导 LRRK 在细胞器膜上的募集，并增强 LRRK2 的酶活性（通过 Ser1292 自身磷酸化监测）。LRRK2 诱导 RAB10（Thr73）磷酸化，进而调控纤毛发生、囊泡运输、膜运输和融合。

规格参数

其他规格参数

应用领域：细胞信号传导
品牌：HTRF
检测方式：HTRF
裂解缓冲液兼容性：3 号裂解缓冲液
分子修饰：磷酸化
产品类别：试剂盒
样品体积：16 µL
运输条件：干冰运输
靶标类别：磷蛋白
靶标物种：人、小鼠
技术：时间分辨荧光共振能量转移（TR-FRET）
单位规格：500 个检测点

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货号：64RABT73PEY

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